Генная терапия

Основные методы генотерапии

Генная терапия — использование генетического материала для лечения или профилактики болезней. В зависимости от поставленной задачи, применяются разные стратегии, включая добавление нового генетического материала в клетки или блокирование активности «больного» гена. Например, гемофилия типа В обусловлена недостаточностью фактора IX — белка, играющего важную роль в процессах свертывания крови. Долгое время единственным методом устранения этой проблемы было периодическое переливание плазмы крови, которое после заменили на введение в организм концентрата протромбинового комплекса. Последний метод имел существенный недостаток: он часто приводил к развитию тромботических эпизодов. С появлением генной терапии ученые научились создавать рекомбинантные «версии» фактора IX, которые отличаются высокой эффективностью и безопасностью.

Генная терапия направлена на модификацию генетического материала соматических клеток человека, не принимающих участие в половом размножении. Редактирование клеток зародышевой линии запрещено законодательством более чем 40 стран и Советом Европы.

Изменения генома соматических клеток не передаются по наследству и затрагивают только определенные клетки-мишени.

25 ноября 2018 года китайский биофизик Хэ Цзянькуй опубликовал на ютубе видео, в котором объявил о рождении девочек-близнецов Лулы и Наны — первых в мире детей с измененным геномом клеток зародышевой линии. Для исследования отбирались пары, в которых мужчина был ВИЧ-положительным, а женщина — ВИЧ-отрицательной. После взятия спермы и яйцеклеток у испытуемых проводилось ЭКО. Геном полученных эмбрионов изменялся с помощью технологии CRISPR-Cas9. Во время геномного редактирования «выключался» ген CCR5, позволяющий ВИЧ проникать в клетку.

Новость была тут же подхвачена китайскими СМИ, которые окрестили ее «историческим прорывом в области редактирования генома». Но уже через сутки после выхода ролика 122 китайских ученых выступили с заявлением, что эксперимент ученого безумен и связан с неконтролируемыми рисками, включая возникновение нецелевых мутаций.

После проведения тщательного расследования лабораторию Хэ Цзянькуя закрыли, а самого ученого приговорили к трем годам тюремного заключения. Личности Лулы и Наны как были, так и остались засекреченными. Никаких данных о них, кроме заявления Хэ Цзянькуя о хорошем самочувствии детей, на данный момент нет.

Выделяют две основные методики генотерапии — ex vivo и in vivo. Оба метода востребованы: с 2010 по 2020 год проведено 1035 клинических испытаний ex vivo и 872 in vivo.

Терапия ex vivo состоит из следующих этапов:

Осуществляется забор дефектных клеток.
В лаборатории в геном проблемных клеток вносятся нужные изменения, после чего они «размножаются».
Измененные клетки вводятся в организм пациента.

Одно из ключевых направлений технологии ex vivo — лечение патологий, связанных с пересадкой костного мозга. Стволовые клетки костного мозга можно трансформировать в разные типы клеток, включая макрофаги, тромбоциты, эритроциты. Например, при дисфункции макрофагов генотерапия ex vivo обеспечит пациенту достаточный запас этих иммунных клеток из популяции модифицированных стволовых.

Технология in vivo — доставка терапевтического гена, способного корректировать генетический дефект, к нужным клеткам. К мишеням данной терапии относятся злокачественные опухоли, костный мозг, глаза, центральная нервная система, сердце, печень.

Для транспортировки генетического материала к целевым клеткам в обоих случаях применяются различные системы доставки (векторы).

Наиболее часто доставщиками выступают вирусы, обладающие природной способностью внедряться в клетки хозяина.

Перед использованием вируса из него «достают» гены, которые отвечают за заражение и репликацию, и заменяют их на лечебные. После этого вирус вводят в организм, где он поражает целевые клетки и обеспечивает экспрессию лечебных генов. Таким образом, ученым удалось превратить патогены, вызывающие заболевания, в эффективные лечебные инструменты.

Выбор вируса-переносчика зависит от применяемой технологии и конечной цели лечения. Например, лентивирус и ретровирус эффективны при терапии ex vivo, аденоассоциированный вирус (AAV) — при терапии in vivo. Последний относится к наиболее популярным векторам: он может поражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, и обеспечивает долгую экспрессию терапевтического гена.

Разрушители раковых опухолей

Большинство клинических испытаний генотерапии сосредоточено на лечении онкологии. Одно из перспективных направлений — применение CAR T-клеток для воздействия на адаптивный иммунитет и активации противоопухолевого ответа.

Боеспособность адаптивного иммунитета зависит от «умения» Т-клеток (Т-лимфоцитов), образующихся в костном мозге, распознавать чужеродные антигены. Мишени Т-клеток — бактерии, вирусы, опухолевые клетки. Последние умеют «ускользать» от иммунологического контроля организма.

Взаимодействие иммунной системы и опухоли состоит из трех стадий:

Элиминация. Эпитопы, вырабатываемые злокачественными клетками, распознаются и уничтожаются Т-лимфоцитами. Кроме того, к иммунному ответу подключаются клетки врожденного иммунитета — естественные киллеры, макрофаги.
Равновесие. Злокачественные клетки постепенно мутируют и становятся неузнаваемыми для Т-лимфоцитов. Для стадии «равновесия» характерна одинаковая скорость роста и гибели раковых клеток.
Ускользание. Злокачественные клетки полностью адаптируются к иммунному ответу и начинают размножаться бесконтрольно.

В 1989 году ученые нашли возможность превращать Т-клетки в «охотников» на онкологию. Был создан химерный антигенный рецептор (Chimeric antigen receptor, CAR), который наделяет Т-лимфоциты способностью распознавать антигены злокачественных клеток.

Получить CAR T-клетки можно как in vivo, так и ex vivo. В первом случае в организм вводятся наночастицы, которые трансформируют обычные Т-лимфоциты в CAR T-клетки, во втором — иммунные клетки пациента перепрограммируются в лаборатории и вводятся обратно в организм.

В 2008 году ученым с помощью CAR T-клеток удалось победить нейробластому: у трех из одиннадцати пациентов была достигнута полная ремиссия. С этого момента начался бум исследований CAR T-клеток для терапии рака.

CAR T-клетки эффективны при множественной миеломе и злокачественных заболеваниях крови, включая острый лимфобластный лейкоз — самый распространенный вид рака в детском и юношеском возрасте.

FDA и другими агентствами по контролю за качеством лекарств одобрено 8 противоопухолевых препаратов на основе CAR T-клеток, включая препараты для лечения миеломы, лимфомы, острого лимфобластного лейкоза.

В последнее время возрос интерес ученых к NK-клеткам (естественным киллерам), которые после CAR-модификации демонстрируют мощный противоопухолевый потенциал. Было проведено много доклинических исследований, а в настоящее время проводится несколько клинических для оценки боеспособности естественных киллеров. Некоторые из них демонстрируют, что CAR NK-клетки — более эффективные и безопасные инструменты в борьбе с раком, чем CAR T-клетки.

Надежда для людей с генетическими патологиями

На долю генетических заболеваний приходится меньше клинических испытаний генотерапии, чем на долю онкологии, однако наследственные патологии — лидеры по количеству одобренных генотерапевтических препаратов. Сегодня существуют одобренные препараты для таких тяжелых болезней:

Миодистрофия Дюшенна, при которой поражаются скелетная мускулатура, нервная, пищеварительная, выделительная система, миокард. Смерть при этой болезни обычно наступает на втором-третьем десятилетии жизни.
Амавроз Лебера — патология сетчатки, приводящая к ослаблению или полной потере зрения.
Тяжелый комбинированный иммунодефицит. Пациенты с этим заболеванием очень уязвимы перед инфекциями и вынуждены находиться в стерильной среде.

Первое успешное клиническое испытание генотерапии было проведено в 1990 году американскими учеными под руководством Френча Андерсона. 4-летней пациентке с тяжелым комбинированным иммунодефицитом ввели в организм ген ADA, кодирующий аденозиндезаминазу — фермент пуринового метаболизма, недостаток которого провоцирует нарушение клеточного и гуморального иммунитета.

Лечебный эффект длился несколько месяцев. За последующие три года девочка прошла более 20 процедур генотерапии. Несмотря на изматывающие лечение, его цель была достигнута: состояние пациентки улучшилось настолько, что она смогла вести полноценный образ жизни.

Одобрены препараты для генотерапии некоторых наследственных метаболических нарушений, включая семейную гиперхолестеринемию. Для этого заболевания характерен высокий уровень «плохого» холестерина, что повышает риск раннего развития атеросклероза и связанных с ним сердечно-сосудистых заболеваний.

Существуют генотерапевтические препараты для СМАйликов — детей со спинальной мышечной атрофией (СМА). Патология обусловлена дефектами в генах, отвечающих за продукцию белка выживаемости мотонейронов (SMN). Заболевание сопровождается дисфункцией мышц и вентиляционной недостаточностью. Это ведущая генетическая причина смерти у детей раннего возраста.

Проводятся клинические испытания препарата для детей младше двух лет Zolgensma — копий гена, кодирующего белок SMN. Одно из них оценивало лечебный эффект различных доз. Через два года после генотерапии испытуемому из группы низкодозированного лечения потребовалась постоянная вентиляция легких, в то время как всем испытуемым из группы высокодозированного лечения она была не нужна. Ни один из СМАйликов, получавших низкие дозы препарата, не мог сидеть без поддержки, стоять или ходить.

75% детей из группы высокодозированного лечения могли сидеть без поддержки в течение ≥ 30 секунд, 16,7% — самостоятельно стоять и ходить.

Генотерапия проникает во все медицинские отрасли

Кроме лечения онкологии и наследственных заболеваний, генотерапия применяется и в других медицинских целях. Создаются ДНК-вакцины для профилактики инфекций, включая COVID-19, препараты для лечения синдрома хронической усталости, диабетической нейропатии, аллергического ринита, ишемии нижних конечностей. Последнее заболевание лечится и с помощью разработки российских ученых с геном VEGF 165, который отвечает за образование кровеносных сосудов.

Ведутся разработки генотерапетических средств против сердечно-сосудистых заболеваний — сердечной недостаточности, инфаркта миокарда.

Для лечения сердечной недостаточности в организм пациента с помощью AAV-вектора вводится ген, экспрессия которого положительно влияет на функцию левого желудочка. В ходе клинического испытания состояние большинства испытуемых с прогрессирующей сердечной недостаточностью улучшилось.

Большинство патологий многофакторные, поэтому перспективное направление — введение в организм нескольких генов с разными функциями, что может усилить лечебный эффект. Введение мышам с посттравматическим остеоартритом смеси двух генотерапевтических препаратов с разными свойствами показало большую эффективность, чем монотерапия. Один препарат замедлял разрушение хрящевой ткани, второй обладал противоспалительными свойствами.

Генетические ножницы — будущее генотерапии

Генотерапия с применением векторов будет, безусловно, развиваться и дальше. Но есть и другие решения, способные повысить эффективность генной терапии и сделать ее более доступной. К ним относится технология CRISPR/Cas9, которая также называется генетическими ножницами. В 2020 году эта методика была удостоена Нобелевской премии по химии. С помощью генетических ножниц можно удалять проблемную часть генома и заменять ее на здоровую.

У CRISPR/Cas9 много преимуществ: высокая точность нацеливания на нужные генетические последовательности, простота управления, возможность одновременно редактировать несколько локусов, невысокая стоимость.

Сегодня с помощью CRISPR/Cas9 редактируются геномы многих микроорганизмов, растений и животных. Технологию активно применяют для совершенствования штаммов, улучшения генетики сельскохозяйственных культур и домашнего скота.

Лечебный потенциал CRISPR/Cas9 в отношении различных заболеваний изучается на животных моделях. Технология показала эффективность при лечении индуцированной катаракты, рака желудка, заболеваний головного мозга, легких, печени.

Проводились и клинические испытания CRISPR/Cas9. В 2016 году с ее помощью создали модифицированные Т-лимфоциты, в 2020-м — применили для лечения пациента, ослепшего из-за врожденного амавроза Лебера.

Вирусы-доставщики и убийцы раковых клеток: как работает генная терапия