Радикальное омоложение. Как ученые научились превращать клетки организма в любые другие — и лечить так врожденные заболевания

ИПСК — технология возврата клеток в «детство»

В человеческом организме обитают миллиарды клеток, которые в зависимости от функционала подразделяются более чем на 200 видов. Поразительное клеточное разнообразие имеет довольно скромное начало в одной оплодотворенной яйцеклетке. В процессе ее дробления образуется бластоциста, внутренние клетки которой называют эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК).

ЭСК также называются плюрипотентными клетками, так как они могут дифференцироваться (превращаться) в любые другие. Взрослея, клетки утрачивают плюрипотентность и неограниченную свободу выбора своей «судьбы». В отличие от ЭСК, стволовые клетки взрослого организма способны превращаться лишь в определенные типы клеток. У специализированных клеток, обладающих уникальной морфологией и выполняющих конкретные функции, способность к дифференцировке и вовсе отсутствует.

Анча Баранова, доктор биологических наук, профессор:

«Стволовые клетки стоят во главе клеточной иерархии. Они „обитают“ в организме в строго определенных местах, в отдельных резервуарах. Стволовые клетки довольно ленивые: они делятся медленно и только для того, чтобы восполнить ряды клеток-предшественников.

Клетки-предшественники, наоборот, делятся активно, но у них более узкая специализация, чем у стволовых. В процессе деления клеток-предшественников появляются полностью специализированные клетки-работники, выполняющие определенную программу. Например, к ним относятся эпителиальные, мышечные клетки.

Жизнь этих специализированных клеток напоминает жизнь в тюрьме: у них нет никакой свободы, каждая клетка сидит ровно и делает то, что ей скажут. А если кто-то начинает от программы отклоняться, тому сразу по башке! Клеток-бунтарей уничтожают клетки иммунной системы, которых так и называют — „киллеры“. Либо они, получив сигнал „убить себя о стену“ извне, заканчивают жизнь суицидом. Также они могут сами прийти к мысли, что им пора начать себя изнутри переваривать, например, в связи со снижением эффективности собственного труда.

Работа организма расписана по принципу ГУЛАГа, что просто необходимо для нашего выживания. Чем больше у клетки свободы, тем хуже для организма.

Клетка, сбежавшая из тюрьмы, способна к трансдифференцировке — превращению в другой тип клеток. Это может стать причиной образования опухоли. Например, эпителиальные клетки приобретают свойства мезенхимальных, начинают ползать вокруг, а ползающая клетка — это уже почти готовое зерно для метастаза.

Ползающая клетка способна проникнуть в сосуд, пробраться по нему в другое место организма и там закрепиться. Именно потому за несвободными специализированными клетками постоянно следят клетки-надзиратели, которые представляют собой компоненты иммунной системы».

Долгое время считалось, что у специализированных клеток (как и у взрослых людей) нет обратной дороги в «детство» (плюрипотентное состояние). Возможность перепрограммирования эмбриональных клеток в специализированные была доказана еще в середине XX века, а вот осуществить обратный процесс ученым долго не удавалось. Дело сдвинулось с мертвой точки, когда в 2006 году японский ученый Яманака смог вернуть мышиные фибробласты в плюрипотентное состояние с помощью введения в них четырех генов, кодирующих определенные транскрипционные факторы. Экспрессия этих генов изменила метаболизм клеток и обнулила их возраст. Полученные плюрипотентные клетки назвали ИПСК, а комбинацию «омолаживающих» транскрипционных факторов — «коктейлем Яманаки».

С открытием ИПСК появилась возможность придать многим клеткам нашего организма свойства эмбриональных стволовых клеток, обладающих неограниченным потенциалом к дифференцировке. В лабораторных условиях как ЭСК, так и ИПСК можно превратить практически в любые стволовые и специализированные клетки. Но если применение ЭСК ограничено этическими соображениями, так как их получают из человеческих эмбрионов, то у ИПСК такого недостатка нет. С помощью генной инженерии можно получить много ИПСК из небольшого количества донорского материала, например, из подкожной жировой ткани.

Чаще всего в ИПСК превращают фибробласты, кератиноциты и гемопоэтические стволовые клетки, так как их легко «достать» из организма и они быстро делятся.

Сегодня процесс репрограммирования детально изучается во многих лабораториях в разных странах. Кроме «коктейля Яманаки», апробировано большое количество других методик, возвращающих клетки в «детство».

Анча Баранова:

«ИПСК позволяют получить нужные клетки, в том числе и стволовые, из тканей, которые легко „вытаскиваются“ из организма. Конечно, можно пойти традиционным путем и извлечь стволовые клетки из костного мозга, но тогда вам придется сверлить ногу человеку.

Все клетки имеют определенные характеристики. Если вы засунете какие-нибудь клетки в цитофлуориметр, у них будут определенные поверхностные маркеры. А если вы эти клетки немножко культивируете и введете в них экспрессирующиеся конструкции, содержащие определенные транскрипционные факторы, то они откатятся назад в своей дифференцировке и их поверхностные маркеры станут другими. Возможна и другая ситуация: подавление „взрослых“ транскрипционных факторов, уже содержащихся в клетках и „заставляющих“ их работать в рамках конкретной специализации, может приблизить их к „детскому“ состоянию.

Процесс перепрограммирования клеток можно разделить на два этапа:

1. Дедифференцировка — вовращение клеток в плюрипотентное состояние.
2. Трансдифференцировка — „лепка“ из плюрипотентных клеток того, что нам нужно.

Разработаны специальные протоколы преобразования одного типа клеток в другой, в которых очень четко прописываются все манипуляции с клетками до момента их переноса в организм человека. Эти методики для каждого типа ткани многократно отрабатывались. Но пока их нельзя назвать совершенными, и ученым есть над чем потрудиться».

Клеточная терапия с использованием ИПСК

Клеточная терапия — лечебная методика, восстанавливающая поврежденные ткани путем трансплантации стволовых и других видов клеток. Она применима для лечения сердечно-сосудистых, нейродегенеративных заболеваний, патологий кровеносной, мышечной, костной систем.

Создание технологии ИПСК расширило возможности клеточной терапии, так как с помощью нее можно быстро создать любой биоматериал для трансплантации. При получении биоматериала из ИПСК самого пациента исключается риск иммунного отторжения.

Кроме того, ИПСК могут применяться и для коррекции генетических дефектов, ставших причиной тяжелого врожденного заболевания. Сегодня существуют генотерапевтические препараты, способные устранять «поломку» генов. Но они малоэффективны по отношению ко взрослому организму, так как дифференцировка его клеток, формирование тканей и органов происходили под воздействием причинной мутации. Если отредактировать геном клеток в плюрипотентном состоянии, их дальнейшая дифференцировка пройдет без отклонений. Зачастую для редактирования генома ИПСК применяют технологию CRISPR-Cas9, которая «вырезает» дефектные гены.

Клеточная терапия с использованием ИПСК сейчас проходит испытания как на животных моделях, так и на людях, и результаты — многообещающие.

В 2014 году японские ученые трансплантировали в роговицу пациента с возрастной макулярной дегенерацией клетки пигментного слоя сетчатки, полученные из ИПСК. Лечение улучшило зрение испытуемого и не вызвало побочных эффектов. Последующие испытания этой методики на других пациентах показали аналогичные результаты. Сейчас ученые проводят исследование по трансплантации клеток роговицы, полученных из ИПСК.

Одно из самых тяжелых осложнений трансплантации костного мозга — реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), которая проявляется воспалением в различных органах. Воспаление возникает оттого, что донорские клетки при попадании в ослабленный организм реципиента ведут себя агрессивно и нападают на клетки нового «хозяина», которые кажутся им чужеродными. Это и приводит к развитию РТПХ. Основной метод лечения — кортикостероиды. Однако существует стероид-резистентная РТПХ, смертность при которой достигает 80%.

В ходе клинических исследований было обнаружено, что введение в организм мезенхимальных стромальных клеток (МСК), обладающих иммуномодулирующим потенциалом, подавляет реакцию «трансплантат против хозяина». МСК-терапия работает даже при очень тяжелой РТПХ: смертность среди пациентов, прошедших лечение, снижается почти в два раза. Однако в ходе исследований ученые столкнулись с проблемами: нестабильностью лечебного эффекта и сложностью получения МСК в достаточном количестве. Иммуномодулирующие и другие свойства МСК варьируют от донора к донору. Подбор же подходящего донорского материала — длительный и дорогостоящий процесс.

Решить эти проблемы удалось с помощью генерации МСК из ИПСК, позволяющих получить неограниченное количество биоматериала с нужными свойствами из одной порции донорской крови. На основе этой технологии был создан препарат CYP-001, предназначенный для лечения синдрома «трансплантат против хозяина».

Клиническое испытание препарата продемонстрировало более высокую эффективность и выживаемость пациентов по сравнению со стандартной МСК-терапией. Какие-либо серьезные побочные эффекты не наблюдались.

В 2018 году FDA присвоила CYP-001 статус орфанного препарата. Ожидается, что в начале 2024 года станут известны результаты 2-й фазы его клинических испытаний.

Кроме лечения РТПХ, у CYP-001 есть и другое клиническое применение. Препарат уже тестируется на взрослых, поступивших в отделение интенсивной терапии с дыхательной недостаточностью, вызванной Covid19.

Клеточная терапия с использованием ИПСК успешно протестирована на животных моделях болезни Паркинсона (БП) — нейродегенеративного заболевания, обусловленного гибелью дофаминергических нейронов (ДА-нейронов) в так называемой «черной субстанции» головного мозга. В результате недостатка дофамина пациентам с БП свойственны скованность мышц, замедленность движений, тремор.

Японские ученые перепрограммировали человеческие ИПСК в предшественников ДА-нейронов и ввели в мозг обезьян с индуцированной болезнью Паркинсона. За макаками наблюдали два года. Трансплантация нервных клеток значительно улучшила неврологический статус, моторику и поведение животных. Дальнейшее гистологическое исследование обнаружило, что у каждого животного выжило более 100 тыс. пересаженных ДА-нейронов. В 2018 году началось клиническое испытание этой технологии на людях.

На основе ИПСК создаются методики лечения сердечно-сосудистых заболеваний, различных видов рака, повреждений спинного мозга. В 2021 году успешную трансплантацию трансдифференцированных бета-клеток провели грызунам с диабетом.

Анча Баранова:

«Пример заболевания, к которому может быть применима клеточная терапия с использованием ИПСК, — сахарный диабет 1-го типа, развивающийся преимущественно у детей. В основе СД 1 лежит аутоиммунный процесс: организм разрушает собственные бета-клетки поджелудочной железы (ПЖ), отвечающие за выработку инсулина. Многие родители детей с диабетом связывают развитие заболевания с прививками либо инфекциями, так как часто СД 1 манифестирует после них. На самом деле гибель бета-клеток начинает за 1,5–2 года до клинических проявлений болезни, а прививки и инфекции — лишь ее „ускорители“, добивающие уже пострадавшие бета-клетки.

Сегодня единственный способ компенсации СД 1 — пожизненные, регулярные инъекции инсулина. И хотя этот способ обеспечивает хорошую выживаемость диабетиков и позволяет многим вести нормальный образ жизни, понятно, что он неоптимальный. Более эффективное решение — восстановить каким-то образом нормальную работу ПЖ. Например, с помощью трансплантации функциональных бета-клеток.

Для трансплантации могут использоваться аутологичные или аллогенные клетки. Аутологичные — собственные клетки, которые не будут отторгаться организмом. При их пересадке не нужно применять иммунодепрессанты. Аллогенные — клетки, взятые у других людей, их трансплантация требует иммуносупрессии.

Если аутологичные клетки дедифференцировать ex vivo (вне организма) в ИПСК, а после перепрограммировать в бета-клетки и подсадить в организм диабетика, то они будут какое-то время вырабатывать инсулин. Длительность их работы будет зависеть от нескольких факторов, главный из которых — наличие либо отсутствие иммунного ответа против бета-клеток. Чтобы аутоиммунный процесс затих, между манифестацией диабета и началом лечения с помощью ИПСК должно пройти определенное время».

Применение ИПСК для моделирования заболеваний

С помощью ИПСК ученые быстро и дешево могут создавать модели различных заболеваний, обусловленных нарушением работы генов. Доступный источник ИПСК — фибробласты, которые легко получить с помощью биопсии, а потом культивировать. Культуры фибробластов, взятые у пациентов с теми или иными заболеваниями, с помощью транскрипционных факторов превращают в ИПСК, а после перепрограммируют в нужные специализированные клетки. Например, при нейродегенеративных заболеваниях их перепрограммируют в тот или иной вид нейронов. Полученные нейроны имеют патологические особенности, свойственные заболеванию пациента. Изучение этих особенностей позволяет установить механизмы развития болезни и способы ее устранения.

Наиболее часто ИПСК применяют для создания моделей заболеваний системы кровообращения, болезни Паркинсона и дегенерации сетчатки.

Значительный прогресс в моделировании заболеваний произошел с разработкой органоидов из ИПСК. Органоиды — трехмерные (3D) культуры клеток, повторяющие некоторые ключевые особенности морфологии и функций определенного органа.

Пионером в создании органоидных структур был голландский генетик Ханс Клеверс, продемонстрировавший возможность получения органоидов кишечника из стволовых клеток. После ученые научились создавать органоидные структуры других частей человеческого организма. С открытием ИПСК этот процесс значительно упростился.

С помощью ИПСК были получены органоиды различных мозговых структур, что позволило смоделировать множество неврологических заболеваний, психических расстройств и понять их особенности. Например, нейронные органоиды из ИПСК, полученных от пациентов с синдромом Ретта, продемонстрировали, что при этом заболевании нарушается нейрогенез и снижается миграция нейронов. Кортикальные органоиды из ИПСК пациентов с синдромом Миллера—Дикера показали апоптоз нейронов в желудочках головного мозга.

Нейронные органоиды из ИПСК используют и для изучения различных видов рака головного мозга. Для этого в мозговые органоиды, содержащие нервные стволовые клетки и клетки-предшественники, с помощью векторов вводятся мутации, свойственные тем или иным опухолям.

Кроме органоидов мозга, на основе ИПСК создают и органоидные структуры желудочно-кишечного тракта, печени, легких, сердца.

Модели заболеваний, созданные с помощью ИПСК, применяются для скрининга лекарств. Первый крупномасштабный скрининг был проведен в 2009 году, когда трансдифференцированные клетки пациента были использованы для моделирования синдрома Райли-Дея. Изучая экспериментальную модель, ученые обнаружили три важных параметра, свойственных заболеванию. Затем они протестировали на модели некоторые препараты-кандидаты и оценили, как они влияют на эти параметры. Таким образом удалось установить, что гормон кинетин смягчает проявления синдрома.

Позже этот клеточный подход использовался для тестирования препаратов против рака толстой кишки, прогрессирующего фиброза, болезни Альцгеймера, шизофрении и других тяжелых заболеваний.

Ограничения использования ИПСК

Несмотря на то, что ИПСК были открыты в 2006 году, их довольно редко применяют на людях и медленно внедряют в клиническую практику. Частично это связано с результатами исследований, которые продемонстрировали вероятность злокачественной трансформации клеток, полученных из ИПСК. Сейчас активно разрабатываются новые методы модификации ИПСК, снижающие риск озлокачествления трансдифференцированных клеток.

Кроме того, ИПСК относятся к клеточным технологиям, продвижение которых тормозится слишком жесткой регуляторикой.

Анча Баранова:

«Существует обратная связь между старением клеток и онкологией. Из постаревших клеток рак не получится. Чтобы клетка стала раковой, ее нужно вернуть в «молодость». А «молодость» клетки — это и есть состояние стволовости.

Клетки не все одинаковые. Если вы возьмете сообщество клеток (а ученые всегда работают с сообществом), то несмотря на схожесть, они будут немного друг от друга отличаться: у одних клеток геном будет более сбалансированным, у других — более разболтанным. И когда вы это сообщество клеток вернете в плюрипотентное состояние, то у клеток с более разболтанным геномом появится шанс выйти из-под узды дифференцировки. А ведь для развития опухоли достаточно всего нескольких клеток, которые вышли из-под контроля и пошли по пути усиления канцерогенности. Кроме того, иммунная система реципиента может быть более или менее реактивна к опухолевым клеткам. Сочетание этих двух факторов (неизвестной силы противораковой защиты у пациента и неизвестной способности клеток к злокачественному перерождению) дает неопределенность, которую невозможно измерить. Ученые стараются снизить риск развития рака, но 100-процентной гарантии безопасности нет.

Но 100-процентной гарантии безопасности чего-либо не существует, и именно требование этой гарантии тормозит развитие клеточной терапии.

Главный «жандарм» клеточных технологий — FDA, и его принцип работы примерно такой: докажите абсолютную безопасность методики — и тогда, возможно, мы ее разрешим. Это замедляет внедрение в клиническую практику разработок ученых.

Одна из стран, которая уже давно смотрит с высокой горки на FDA, — Китай. Китайцы свою медицинскую систему полностью отмежевали и каким-то образом решили проблему регуляторики исследований. И результат на лицо: у них одобрены онколитические вирусы, которыми лечат рак, множество видов CAR-T терапии для самых разных опухолей. И последняя стоит не 3 млн долларов, как в США, а 200 тысяч. В результате люди едут лечить рак не в США, а в Китай.

Чтобы удержаться на плаву, FDA придется учитывать конкурентов и ослаблять регуляторику. Это уже происходит: за последние 2–3 года было одобрено несколько революционных продуктов, и эта тенденция будет усиливаться».